Estudio caso-control del papel de los marcadores de peroxidación lipídica en el desarrollo del cancer de mama. Relación con factores de riesgo y loci de susceptibilidad ya conocidos

Investigador Principal (IP): Gago Domínguez, Manuela Código: PI12/02125
Convocatoria: ayudas Acción Estratégica en Salud 2012 (AES 2012) – ISCIII
Presupuesto: 139.295,90€  Fecha inicio:dd/mm/2012  Duración: 3 años
Objetivos:

Al plantear este estudio, se perseguían los siguientes objetivos:

1. La realización de un estudio caso-control evaluando el papel de productos de la peroxidación lipídica (PL)o isoprostanos(isoP) en orina y muestras de aspirado de pezón (NAF, siglas en inglés), en el desarrollo del cáncer de mama (CM).

1.1. Determinar si el efecto de los factores de protección ya establecidos para el CM, incluyendo edad temprana a primer embarazo/ a término, elevada paridad, ooforectomía, edad tardía de menarquia, edad temprana de menopausia, obesidad pre-menopáusica y actividad física, está asociado con niveles elevados de isoP en orina y/o NAF.

1.2. Determinar si el incremento en el riesgo para CM de factores de riesgo establecidos, incluyendo estatura, ingesta de alcohol, terapia de reemplazo hormonal, y obesidad postmenopaúsica, está asociado con niveles disminuidos de isoP en orina y/o NAF.

2. Determinar si el aumento en el riesgo de CM de los loci de susceptibilidad identificados a través de estudios GWAS, está asociado con el nivel de los isoP en orina y/o NAF

Palabras clave:cáncer de mama (CM), tumor maligno, peroxidación lipídica (PL), isoprostanos (isoP), niveles sangre/ orina, aspirado de pezón (NAF en inglés),herramienta de diagnóstico, factores de riesgo/ protección, loci, variaciones genéticas,MassARRAY, Genome-Wide-Association-Screening (GWAS), Single-Nucleotide Polymorphims (SNPs), análisis estadístico.

EQUIPO

Apellidos Nombre Titulación/ Categoría y Entidad
Gago Domínguez Manuela Medicina, doctor/ IP(*) CHUS
Carracedo Angel Medicina, doctor/ Colaborador, FPGMX
Castelao Esteban Medicina, doctor/ Investigador, CHUVI
Novo Domínguez Alejandro Medicina, doctor/Jefe de Servicio- Ginecología, CHUS
Peña Maite Medicina, doctora/ Adjunta – Ginecología, CHUS
Redondo Carmen Química Computacional, doctora/ Investigadora, CHUVI
Ruíz Larrea Mª Begoña Medicina, doctora/ Profesora universitaria, UPV
Ruíz Sanz José Ignacio Medicina, doctor/ Profesor universitario, UPV
Torres María Biología Molecular, licenciada/ Colaboradora, CEGEN
ND ND Personal enfermería/ colaboradores,(CHUS, CHUVI),
ND ND Técnico de laboratorio/ colaboradores(CHUS, FPGMX, UPV)

IP: Investigador Principal

ENTIDADES PARTICIPANTES Y COLABORADORAS

Nombre Siglas Tipo/ Categoría
Centro Nacional de Genotipado,

Nodo en Galicia del Instituto de Salud Carlos III

CEGEN /

ISCIII

Organismo público /

Asistencial e investigación clínica

Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica FPGMX Organismo público
Complexo Hospitalario Universitario de Santiago CHUS Hospital público
Complexo Hospitalario Universitario de Vigo CHUVI Hospital público
Servizo Galego de Saúde SERGAS Organismo público
Universidad del País Vasco UPV Organismo público
Universidade de Santiago de Compostela USC Organismo público

Antecedentes e hipótesis de partida

El cáncer de mama (CM) es actualmente el tumor maligno más frecuente entre las mujeres, por lo que es esencial desarrollar una herramienta de evaluación del riesgo de CM. La existencia de dicho (bio-)marcador/ herramienta, debierafacilitar la identificación de mujeres con riesgo elevado y lograr incrementar las posibilidades de supervivencia de las pacientes, al permitir una intervención más temprana.A día de hoylas dos pruebaspara la detección de CM recomendadas por la Sociedad Americana del Cáncer son el examen clínico de los senos y la mamografía.Mediante éstaúltima, sin embargo, no se detectan entre un 20-30% de los cánceres (hablamos de 350 mujeres por cada 100.000 con CM y con edades comprendidas entre75-105), ya que el CM puede yacer oculto por otro tejido denso de la mama. Así mismola mamografía no detecta cambios anormales hasta 8 años después de que éstos se inicien y a las mujeres menores de 40 años, no se les realizan mamografías.

La evidencia experimental, en la fecha de inicio de este estudio, sugería que la más poderosa y consistente influencia en la protección del CM estaba directamente relacionada con la generación de productos de la PL. Múltiples estudios sugerían que un aumento en los niveles de dichos productosdesempeñaba un importante papel protector. Así la inhibición del crecimiento del CM por los ácidos grasos poli-insaturados, tales como los omega 3 (AG n-3), alpha-linolénico, conjugado linoleico y gamma linolénico (GLA), tanto in vivo como in vitro,está directamente relacionada con la generación de PL en las células tumorales. Por ello la presencia de compuestos resultantes de la PL, los isoP, en muestras de orina y aspirado de pezón, eran una opción prometedora como (bio-)marcadores/ herramientas.

La PL desempeña pues un papel induciendo la apoptosis y constituye por ello un mecanismo protector en la carcinogénesis de mama (1-4). Los isoP, medidos en orina o en NAF, podrían ser marcadores efectivos para el cribado de CM (1-4) y un estudio de un tamaño muestraladecuado,determinaría si las mujeres diagnosticadas con CM exhiben niveles disminuidos de isoP, en comparación con aquellas no diagnosticadas.

Así mismo,se estudiará el papel y/o factor genético en el CM, es decir, aquellas variantes genéticas comunes que se asocian con el riesgo de padecerlo/ desarrollarloy que hayan sido identificados gracias a estudios deGenome-Wide-Association-Screening(GWAS).Los GWAS han surgido como un enfoque nuevo y poderoso para identificar loci de susceptibilidad de baja penetrancia.

Referencias:

(1) Gago-Domínguez M, Castelao J, Pike MC et al.Cancer Epidem Biom Prev 2005;14:2829-39.

(2) Gago-Dominguez M, Jiang X, Castelao JE. Breast Cancer Res 2007;9:201.

(3) Gago-Dominguez M, Jiang X, Castelao JE. Med Hypotheses 2007;68:1138-43.

(4) Gago-Dominguez M, Castelao JE. Crit Rev in Oncology/Hematology 2008;68:107-14.

Población de estudio.

Las mujeres participantes en el estudio (casos y controles) fueron identificadas en el Servicio de Ginecología del Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS). Se trataba de mujeres de entre 20 y 85 años de edad, no embarazadas, con CM incidente (confirmado clínica o histológicamente), sin tratar, que no hubieran sido diagnosticadas con otro tipo de cáncer en los últimos 5 años (excepto cáncer de piel de tipo no melanocítico) y que dieron su consentimiento por escrito. Los controles eran mujeres de entre 20 y 85 años de edad, no embarazadas, sin historia previa de cáncer (excepto cáncer de piel de tipo no melanocítico) que dieron su consentimiento por escrito. Casos y controles fueron apareados en función de la edad (± 5 años).

En cuanto al tamaño del muestreo, se estimó en función del origen de las muestras:

– orina: se tomaron500 muestras de cada (casos y controles) para tener un 90% de potencia que permitiese detectar una asociación (OR=0.7-0.8) entre los niveles de los isoP y el riesgo de CM, usando un modelo de regresión logística (programa nQueryAdvisor 7.0 (1) con un nivel de significancia del0.05yuntestbilateral).

– NAF: de entre las 500 mujeres iniciales con CM, la colección de muestra se realizó en 150 mujeres que cumplían el requisito de ser premenopáusicas. Así con 150 casos y 150 controles,se obtendría también unapotencia del 90%, detectándose una asociación (OR=0.6-0.7) entre los niveles de los isoP y el riesgo de CM, usando el mismo modelo de regresión logística que para las muestras de orina.

http:// statistical-solutions-software.com

Publicaciones y estado del arte previos a la realización de este estudio

Gago-Domínguez M, Castelao J, Pike MC et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:2829-39.

Gago-Domínguez M, Jiang X, Castelao JE. Breast Cancer Res 2007;9:201.

Sun SY, Hail N, Jr., Lotan R. J Natl Cancer Inst 2004;96:662-72.

Gago-Dominguez M, Jiang X, Castelao JE. Med Hypotheses 2007;68:1138-43.

Gago-Domínguez M, Castelao JE. Critical Reviews in Oncology/Hematology 2008;68:107-14.

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Hunter DJ, Kraft P, Jacobs KB, et al. Nature Genetics 2007;39:870-4.

Stacey SN, Manolescu A, Sulem P, et al. Nature Genetics 2008;40:703-6.

Thomas G, Jacobs KB, Kraft P, et al. Nat Genet 2009;29:29.

Ahmed S, Thomas G, Ghoussaini M, et al. Nat Genet 2009;41:585-90.

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Zheng WJ, Yuan L, Liu XD, Zheng D. J Forestry Res 2005;16:335-8.

Braun S, Krampert M, Bodo E, et al. J Cell Sci 2006;119:4841-9.

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Wu KI, Pollack N, Panos RJ, et al. Am J Physiol 1998;275:L780-7.

Cox A, Dunning AM, Garcia-Closas M, et al. Nature Genetics 2007;39:352-8.

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Howard T, Li Y, Torres M, et al. Blood 1994;83:231-41

En la tabla 1 se indican características y resultados de GWAS publicados hasta la fecha para CM:

Estudio y resultados de GWAS publicados para Cáncer de Mama
Referencia

estudio

Diseño Población Plataforma

genotipado [SNPs]

SNPs

[frecuencia alelo]

Región/gen OR
Easton 200723

 

Ahmed 200929

Estudio BCAC

4-etapas,

caso-control

1ª etapa: 390 casos, 364 controles;

2ª etapa: 3.990 casos, 3.916 controles

3ª etapa: 21.860 casos, 988 CIS,and 22.578 controles

4ª etapa: 33.134 casos, 36.141 controles

High density oligonucleotide,

Sphotolithographic

at Perlegen Sci.

rs2981582 [0.38] *
rs12443621 [0.46]
rs8051542 [0.44]
rs3803662 [0.25]
rs889312 [0.28]
rs3817198 [0.30]
rs2107425 [0.31]
rs13281615 [0.40]
rs981782 [0.47]
rs30099 [0.08]
rs4666451 [0.41]
rs4973768 [0.46]
rs6504950 [0.27]
  10q, FGFR2
  16q12, TOX3
  16q12, TOX3
  16q12, TOX3
  5q11, MAP3K1
  11p15, LSP1
  11p, H19
8q24  
5p  
5q  
2p  
3p24, SLC4A7/NEK10  
17q23, COX11  
1.26
1.11
1.09
1.2
1.13
1.07
0.96
1.08
0.96
1.05
0.41
1.11
0.95
Hunter 200726

 

Thomas 200928

3-etapas: 9.770 casos y 10.799 controlesIniciativa CGEMS. 1ª etapa: 1.145 casos, 1.142 controles

2ª etapa: 4.547 casos, 4.434 controles.

3ª etapa: 4.078 casos, 5.223 controles

Illumina HumanHap500
rs10510126 [0.13] #
rs2420946 [0.38]
rs1219648 [0.39]
rs12505080 [0.27]
rs17157903 [0.12]
rs7696175 [0.44]
rs11249433[0.39]
rs999737 [0.76]
10q
10q, FGFR2
10q, FGFR2
4p
7q22, RELN
4p14, TLR1,TLR6
1p11, NOTCH2/FCGR1B
14q24, RAD51L1
0.62
1.32
1.32
0.93
1.35
0.98
1.16$
0.94$
Stacey 200725

 

Stacey 200827

2-etapas,

caso-control

1ª etapa: 1,600 casos, 11,563 controles.

2ª etapa: 6,145 casos, 33,016 controles

Illumina HumanHap300
rs13387042 [0.497]
rs3803662 [0.269]
rs4415084 [0.396
rs10941679 [0.243]
2q35
16q12, TOX3
5p12
5p12
1.2
1.28
1.16
1.19
Gold 200824

 

3-etapas caso-controlentre judíos Ashkenazi 1ª etapa: 249 casos, 299 controles.

2ª etapa: 950 casos, 979 controles.

3ª etapa: 243 casos, 187 controles

Affymetrix EAv3

500k

rs1078806 [0.399]
rs2180341 [0.211]
10q, FGFR2
6q22, ECHDC1
1.26
1.41
Zheng 200930 3-etapas caso-controlen población china 1ª etapa: 1,505 casos, 1,522 controles.

2ª etapa: 1,554 casos, 1,576 controles.

3ª etapa: 3,472 casos, 900 controles

Affymetrix 500k

 

Human SNP array 6.0

rs2046210 [0.36] 6q25.1,ESR1
1.29
* Frecuencia menor de un alelo en el estudio SEARCH estudio. # MAF entre controles NHS; $ OR heterozigoto

Tabla 1

Población de estudio. Análisis estadístico y genético

Las mujeres participantes en el estudio (casos y controles) fueron identificadas en el Servicio de Ginecología del Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS). Se trataba de mujeres de entre 20 y 85 años de edad, no embarazadas, con CM incidente (confirmado clínica o histológicamente), sin tratar, que no hubieran sido diagnosticadas con otro tipo de cáncer en los últimos 5 años (excepto cáncer de piel de tipo no melanocítico) y que dieron su consentimiento por escrito. Los controles eran mujeres de entre 20 y 85 años de edad, no embarazadas, sin historia previa de cáncer (excepto cáncer de piel de tipo no melanocítico) que dieron su consentimiento por escrito. Casos y controles fueron apareados en función de la edad (± 5 años).

En cuanto al tamaño muestral, según el origen de las muestras:

– orina: se tomaron500 muestras de cada (casos y controles) para tener un 90% de potencia que permitiese detectar una asociación (OR=0.7-0.8) entre los niveles de los isoP y el riesgo de CM, usando un modelo de regresión logística (programa nQueryAdvisor 7.0 (1) con un nivel de significancia del0.05yuntestbilateral).

– NAF: de entre las 500 mujeres iniciales con CM, la colección de muestra se realizó en150 mujeres que cumplían el requisito de ser premenopáusicas, porque sehabíaobservado que la produccióndeNAFeramuyreducidaeneste colectivo(2,3,4). Así con 150 casos y 150 controles,se obtendría también unapotencia del 90%, detectándose una asociación (OR=0.6-0.7) entre los niveles de los isoP y el riesgo de CM, usando el mismo modelo de regresión logística que para las muestras de orina.

En cuanto a las variables, para cada paciente y/o participante en el estudio se recogieron, vía cuestionario de factores de riesgo para CM, los datos que se indican en la tabla siguiente:

 

Nr. Variables Nr. Marcadores
1 Edad(es) 11 IsoProstanos
   al diagnóstico   iPF2α-III, iPF2α-VI, 8,12-  iPF2α-VI,

2,3-dinor-iPF2α-III, d4-5-epi-8,12-iPF3α-VI;

d4,12-8-iPF3α-VI

   a la menarquía    
   a la menopausia

(si procede)

   
2 Menopausia 12 (n= 27) SNPs a analizar en cromosomas:
  Tipo de menopausia

(natural, quirúrgica)

  10q26 [FGFR2: rs2981582, rs10510126, rs1219648,

rs2420946, rs1078806]

  Si menopausica, uso de terapia

hormonal de reemplazo(?)

  16q12 [TOX3:  rs1244362,  rs8051542,  rs3803662]
3 Uso anticonceptivos hormonales   11p15  [LSP1:rs3817198;  H19:rs2107425]
4 Embarazo   5p12 [MRPS30:rs4415084, rs10941679, rs981782]
  Número   5q11 [rs30099; MAP3K1:rs889312]
  Edad al término del 1º   8q24 (rs1281615)
  Problemas de salud (?)   6q22 [ECHDC1: rs2180341]
5 Lactancia materna   2q35 (rs13387042)
6 Enfermedades   2p (rs4666451)
  antecedentes familiares cáncer

(CM en este caso particular)

  7q22 [RELN:rs17157903]
  Diagnósticadas   4p14 [TLR1/TLR6:rs7696175; rs12505080]
7 Medicamentos de uso crónico   1p11 [NOTCH2/FCGR1B: rs11249433]
8 Hábitos de consumo   14q24 [RAD51L1:rs999737]
  Alcohol   3p24 [SLC4A7/NEK10: rs4973768]
  Tabaco   17q23 [COX11: rs6504950]
9 Datos talla   6q25 [ESR1:rs2046210]
  Peso (actual)    
  Antes/ después menopausia    
  Altura    
10 Nivel de actividad física    

Tabla 2

 

En cuanto al análisis estadístico:

– niveles  deisoPyriesgo de CM:seusaron (i) histogramas por separado, para casos y controles,(ii) modelosderegresiónlogística paraanalizar laasociación entreelriesgodepadecer CMyelniveldelosisoP(engeneral oestratificados, según el nivel de los otros marcadores)y (iii)curvasROCexperimentales,paraevaluarlaexactituddelosdistintosisoPalahoradepredecirelriesgo de CM.

Se tuvieron en cuenta así mismo el sexo y la edad en los análisis univariantesy, en el caso de los multivariantes, factoresambientalesygenéticosderiesgoparaelCM. Ante la posibilidad de que el propio crecimiento del tumor pudiera modificar el marcador seleccionado, estudiamos el marcadorestratificadoporestadioygradodediferenciacióntumoral.Hay que destacar que, en la fecha de planificación, sólo exstía un estudio/ precedente en el que se hubieran examinadolos nivelesdeisoPenNAFenrelación conelestadíodeltumor (5,6).

En cuanto al análisis genético :

– comprobación de la asociación entre las variaciones genéticas (esto es, 27 SNPs) y niveles de los distintos marcadores: se usaron un modelo de regresión lineal del tipo Yi=a + b1’Zi+b2’Giy el test de Armitage [basado en un modelo log- aditivo para la herencia (7)]. Para todo ello se recurrió al PLINK(8).

Referencias:

http:// statistical-solutions-software.com

Bentz J. Oncology News 2009; 4(1): 8-9

Petrakis NL. Cancer Epidemiol biomarkers Prev 1993; 2(1): 3-10.

Jiang X, Castelao JE, Chavez-Uribe E et al. PLoS One 2012; 7(1):e29459. Epub 2012 Jan 6

Kato I, Ren J, Heilbrun LK, Djuric Z. Biomarkers 2006; 11:143-52.

Mannello F, Tonti GA, Pagliarani S, et al. Int J Cancer 2007; 120: 1971-6.

Yen Y, Kraft P. Genetic Epidemiology 2005; 29: 289.

Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, et al. Am J HumGenet 2007; 81:559-75.

Metodología. Cronograma y Trabajo realizado

Reclutamiento pacientes y recogida de muestras.Las candidatas a participar en este estudio fueron informadas por su ginecólogo habitual y, aquellas que accedieron a participar, donaron muestras de sangre, orina y líquido de aspirado de pezón. Las muestras de orina y NAF se enviaron posteriormente a la UPV y las de sangre a la FPGMX, procediéndose a su análisis.

Cuestionarios.Recurrimos a cuestionarios de factores de riesgo para CM, validados por el Instituto Nacional de Salud de los EEUU (NCI), y que habían sido ya empleados satisfactoriamente en los estudios ELLA del MD Anderson y la Universidad de Arizona (1)

Análisis de muestras.

Marcadores de peroxidación lipídica en muestras de NAF y orina: dichas muestras fueron analizadas por los doctores Ruíz Larrea y Ruíz Sanz en sus laboratorios de la UPV, según lo planeado, y mediante las técnicas de GC/MS descritas en bibliografía para tal fin (2,3).

De genes:el genotipado de las muestras de ADN genómico (muestras de sangre), se realizó en el CeGen-ISCIII del la USC mediante el método SequenomMassARRAY(estrategia de SBE,single base extensión). La detección de los productos se hizo por espectrometría de masas MALDI-TOF, empleándose2 μL de ADN/ reacción, a una concentración de 10 ng/μL, y llegándose a analizar hasta 36 SNPs/reacción (4).

Análisis de datos. Los datos extraídos de los cuestionarios de factores de riesgo para CM, la historia clínica y los resultados de los análisis de las muestras, se procesaron mediante los métodos y el software estadístico disponible, esto es, R, SPSS y PLINK.

Referencias:

(1) www.ellastudy.medicine.arizona.edu/

(2) Lawson JA, Rokach J, Fitzgerald GA. J BiolChem 1999; 274:24441-4.

(3) Schwedhelm E, Boger RH. Clin Chem Lab Med 2003; 41: 1552-51.

(4) Buetow KH, Edmonson M, MacDonald R, et al. PNAS 98 (2001): 581-4.

Limitaciones. No/ Si se observaron las previsibles, esto es, en cuanto a la potencia para detectar errores genéticos menores (R2<0.06). Tampoco se reportaron incidencias destacables, relativas a la toma de muestras (NAF, orina y/o sangre).

Aspectos ético- legales. El estudio se llevó a cabo tal y como se planteó en la propuesta inicial, según la declaración de Helsinki de la Asamblea Médica Mundial de 1996 y de las normas de Buena Práctica Clínica de la Conferencia Internacional de Armonización. Así mismo el estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia y todas las participantes en el mismo dieron consentimiento informado por escrito.

Cronograma. El estudio se realizó/ está realizando en el tiempo estimado según el cronograma a continuación:

cancer mama

 

Tareas/ actividades Etapas e Hitos Recursos Lugar
  1 Selección de participantes y toma de muestras  
1a Selección de participantes, invitación a participar en el estudio Historias clínicas individuales Servicio Ginecología,

CHUS

  1b Toma de muestras de sangre, orina y aspirado de pezón Bombas sacaleche.

Tubos y frascos para recogida muestras, de sangre y muestras de orina.

  1c entrevista epidemiológica de factores de riesgo para el CM Cuestionarios
2 Análisis de muestras  
2a Análisis de muestras de orina y aspirado de pezón para determinar losniveles de marcadores de peroxidación lipídica Análisis (a subcontratar) UPV
  2b Extracción ADN muestras de sangre Medios y material para extracción de ADN CeGen_ISCIII,

USC

  2c análisis genético de las muestras de ADN Análisis CeGen_ISCIII,

USC

3 Análisis de datos  
3a Creación y manejo base de datos.

Introducción de datos recogidos

Ordenadores y

programas informáticos

CHUVI
  3b Análisis estadístico de los datos obtenidos CHUVI
  3c Asistencia a congresos, charla.

Preparación de publicaciones

  Todo el EQUIPO

Aspectos ético- legales. El estudio se llevó a cabo tal y como se planteó en la propuesta inicial, según la declaración de Helsinki de la Asamblea Médica Mundial de 1996 y de las normas de Buena Práctica Clínica de la Conferencia Internacional de Armonización. Así mismo el estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia y todas las participantes en el mismo dieronconsentimiento informado por escrito.

Resultados y publicaciones asociados

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